As amostras para análise por microscopia precisam apresentar dimensões, formato, estado, propriedades radioativas, magnéticas e elétricas adequadas. Nossos serviços de preparação de amostras oferecem algumas ou todas as etapas das diferentes rotas de preparação da amostra.
Para amostras de materiais os procedimentos de preparação disponíveis são o seccionamento, embutimento em resina, moagem, polimento, ataque químico, eletropolimento a jato (para TEM), revestimento (ouro ou carbono). Também é possível realizar o microseccionamento e montagem na grade para a aquisição de imagens TEM através de cortes com facas diamantadas ou cortes e polimentos iônicos.
Para amostras biológicas, a maioria dos procedimentos de preparação compreende as técnicas convencionais, realizadas em temperatura ambiente. Para a microscopia eletrônica de transmissão, é possível o preparo de amostras de tecidos em fragmentos, células em pellet e células cultivadas sobre lâmina ou lamínula (método de flat embedding), por inclusão em resina, com obtenção de cortes ultrafinos depositados sobre tela. Além disso, realizamos também a deposição sobre tela e contrastação negativa de partículas em suspensão (vírus, nanosistemas lipídicos e novos materiais utilizados na veiculação de agentes terapêuticos, entre outras). Já para a microscopia eletrônica de varredura, realizamos a preparação de pequenos organismos, completos ou em fragmentos, amostras de tecidos, células de cultivo sobre lamínulas, suspensões de microrganismos, células ou partículas, biofilmes.
A criopreparação inclui os processos de preparação de amostras que se iniciam com a criofixação, um método de congelamento ultrarrápido, conhecido por vitrificação, o qual permite que a água presente na amostra passe diretamente do estado líquido para o estado de gelo amorfo. A vitrificação evita a formação de cristais de gelo e preserva a estrutura da amostra, mantendo-a o mais próximo do seu estado natural e diminuindo, portanto, a presença de artefatos mais comumente observados na microscopia eletrônica convencional. O CM-UFMG dispõe de dois métodos automatizados de congelamento ultrarrápido, o High-Pressure Freezing, que trata do congelamento das amostras sob alta pressão, e o Freeze-Plunging, que consiste no congelamento por imersão em meio congelante. Após a criofixação, as amostras podem ser processadas de diferentes formas, dependendo dos objetivos de estudo. A criofratura, Freeze fracture, permite a fratura da amostra congelada em fragmentos, cujas superfícies podem ser moldadas e os moldes analisados por microscopia eletrônica de transmissão ou de varredura. A partir de amostras congeladas, pode-se também obter secções ultrafinas (Crioultramicrotomia / Cryo-ultramicrotomy), as quais podem ser imunomarcadas e analisadas sob microscópio eletrônico. Por fim, amostras criofixadas podem passar pelo processo de criosubstituição (Cryo-substitution), no qual as mesmas são contrastadas, desidratadas e incluídas em resina, com elevação gradual da temperatura.
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Os laboratórios de microscopia eletrônica, de transmissão e de varredura, são capazes de obter imagens bi e tridimensionais, com resoluções consideravelmente superiores às possíveis em microscopia óptica, revelando com maior riqueza de detalhes a morfologia de amostras, em escalas micro e/ou nanométricas. As imagens obtidas permitem a identificação, a caracterização e a determinação dos tamanhos das estruturas reveladas com maior precisão, podendo ser utilizadas na pesquisa, desenvolvimento e controle de qualidade. Uma grande variedade de amostras pode ser analisada, de natureza biológica, material e, mesmo, híbrida.
Partículas de mimivírus vistas por microscopia eletrônica de varredura (esquerda) e por microscopia eletrônica de transmissão (direita).
Imagem cedida por Jônatas Santos Abrahão, laboratório de Vírus, Departamento de Microbiologia, ICB, UFMG.
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Este tipo de microscopia fornece informações estruturais detalhadas, fundamentais na caracterização das amostras até a sua organização atômica. A determinação dos arranjos atômicos é usada na identificação de estruturas e fases dos compostos, distorções na estrutura, identificação e determinação de defeitos cristalinos e análise de inclusões e de interfaces. A técnica é indispensável na caracterização de nanoestruturas, permitindo o acesso a informações sobre composição elementar e estrutura do material.
Resolução atômica (HRTEM) de nanopartícula de ouro.
Imagem cedida por Dagoberto Brandão Santos, Departamento de Engenharia Metalúrgica e de Materiais, Escola de Engenharia, UFMG.
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Trata-se da análise por microscopia de amostras em seu estado vítreo, congeladas e mantidas a baixas temperaturas. Quando fotografada em temperaturas criogênicas (77 K), a pressão de vapor da chamada amostra vitrificada é baixa e as proteínas podem, portanto, ser fotografadas em seu estado hidratado. A criomicroscopia permite a visualização de lipossomas, micelas, vírus, bactérias e tecidos, incluindo células, organelas, complexos proteicos, bem como de estruturas moleculares com alta resolução. Permite também estudos temporalmente resolvidos de etapas de crescimento de nanocristais e de transformação de fases.
Lipossomas constituídos por fosfatidilcolina de ovo e dimetilaminoetano-carbamoil-colesterol contendo tartáro emético para tratamento da leishmaniose.
Imagem cedida por Mônica Cristina de Oliveira e Larissa Dutra Coelho, Departamento de Produtos Farmacêuticos, Faculdade de Farmácia, UFMG.
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As fases de um sólido cristalino são caracterizadas pelo arranjo tridimensional regular e particular dos átomos. A microscopia eletrônica de transmissão fornece informações cristalográficas de regiões micro ou nanométricas da amostra permitindo identificar e mapear as fases de pequenas regiões da amostra. Algumas aplicações destas técnicas incluem a identificação de minerais em amostras geológicas, o controle de teor de minérios e rochas, a detecção de polimorfos para distinguir substâncias com a mesma composição química em diferentes fases de um determinado material, a determinação da presença de impurezas em uma fase pura, a caracterização da estrutura de nanomateriais e a identificação de fases cristalinas e polimorfos em materiais poliméricos, entre outros.
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A alta resolução lateral da microscopia eletrônica faz dela extremamente adequada a medidas de distribuição de diversos parâmetros de material nanoestruturados, entre eles área, diâmetro e perímetro. Para esta análise, preparação das partículas bem dispersas na montagem da amostra é a questão chave. Após a coleta de um número de imagens que permita a integração de um bom volume estatístico de partículas, as imagens são processadas para que os parâmetros de interesse em cada partícula possam ser quantificados de maneira individual. De posse desses resultados podemos montar histogramas de distribuição dos diversos valores obtidos.
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Trata-se de análise em microscopia eletrônica de varredura, com a câmara contendo a amostra operando em baixo vácuo. Utilizado com amostras não condutoras, cujo recobrimento da superfície não é indicado, evitando-se deste modo os inconvenientes como o mascaramento de informações e a eventual destruição de feições estruturais delicadas, incapazes de resistirem a condições de alto vácuo.
Estruturas dendríticas de alumínio em ligas fundidas Al-Si.
Imagem obtida por Marcelo da Cruz Costa de Souza, CM-UFMG.
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Utilizando técnicas como a tomografia e o Arranjo de Secções em Série (Serial Section Array – SSA-EM) uma estrutura pode ser reconstruída em 3D pela combinação de suas projeções 2D. A tomografia inclina a amostra em uma grande faixa de ângulos e para cada intervalo de inclinação uma imagem é tomada, desta forma um mesmo objeto é registrado de diferentes pontos de vista e essas imagens são utilizadas para reconstruir o volume fonte.
A reconstrução pelo arranjo de secções seriais consiste, resumidamente, em fatiar a amostra em diversos cortes e tomar imagens das estruturas contidas nesses cortes na ordem em que as fatias foram cortadas e depois, através de métodos computacionais, empilhar essas imagens e reconstruir o volume das organelas de interesse.
A partir de uma série de imagens com diferentes inclinações, a superfície da amostra é reconstruída em um modelo 3D. É possível realizar medidas de altura de estruturas superficiais com precisão de micrometros.
Reconstrução 3D em superfície de implante dentário.
Imagem cedida por Henrique Limborço, CM-UFMG.
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A alta resolução lateral da microscopia eletrônica faz dela extremamente adequada ao estudo de interfaces, espessura de camadas e defeitos em heteroestruturas semicondutoras. Também permite a fácil quantificação de parâmetros importantes na caracterização de materiais bidimensionais, tais como razão de aspecto, diâmetros de Feret e número de camadas. A variedade de sinais gerados pela interação do feixe de elétrons com a superfície da amostra, permite que, associadas às imagens, também sejam possíveis realizar identificação química e estrutural através das técnicas de EDS e difração de elétrons, respectivamente. Consequentemente, mapeamentos químicos e cristalográficos também podem ser obtidos.
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Utilizando de técnicas de imageamento e análise de composição química é possível identificar a presença de defeitos superficiais ou nas primeiras camadas inferiores, para posteriormente corrigi-los com FIB ou com deposição induzida de platina e carbono por feixe de íons (IBID) ou elétrons (EBID).
Chip semicondutor em vista superior e em secção transversal.
Imagens obtidas por Henrique Limborço, CM-UFMG.
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Uma pequena lâmina é extraída de uma amostra sólida e afinada até espessuras inferiores a 100nm, proporcionando a observação em MET.
Extração de lamela por FIB.
Imagens obtidas por Henrique Limborço, CM-UFMG.
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O feixe iônico pode ser varrido na superfície da amostra em padrões definidos, gerando a corrosão da região de interesse com resolução da ordem de nm.
Corrosão por FIB em Si cristalino de um furo circular com 200nm de diâmetro.
Imagem cedida por Wagner Nunes, CM-UFMG.
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A superfície da amostra pode ser modificada por corrosão com o FIB ou por deposição de PT/C, produzindo padrões manométricos que podem constituir desde cristais fotônicos, dispositivos semicondutores simples até arte nanométrica.
Padrão de deposição de platina e corrosão com feixe de íons em poliamida.
Imagens obtidas por Henrique Limborço, CM-UFMG.
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A análise mineralógica por imagens de microscopia eletrônica é um processo automatizado de análise que permite a identificação de minerais em seções polidas assim como a quantificação de diversas características minerais, tais como o seu teor, tamanho de partículas e grãos, grau de associação e liberação mineral. A textura mineral e o potencial de liberação são propriedades fundamentais do minério que motivam o tratamento econômico. Os dados gerados têm importância para geólogos, mineralogistas e metalurgistas na tomada de decisões em relação à otimização de processos, análise da viabilidade da mina e caracterização do minério. Suas aplicações envolvem, entre outras, a melhoria na eficiência de processamento de cobre, níquel, chumbo, zinco, manganês, minério de ferro, areias minerais e metais preciosos como platina, paládio, prata e ouro. Suas capacidades de caracterização de minério também são usadas de forma muito eficaz na avaliação dos alvos de exploração.
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Associado aos detectores de elétrons secundários e elétrons retroespalhados, um detector de raios-x contabiliza o número de fótons de raios-x ejetados da amostra e os discrimina em função de sua energia. Cria-se, assim, um espectro de distribuição energética da amostra, através do qual podemos identificar quais elementos químicos estão presentes na superfície da amostra e também mapear a localização dos mesmos. Superfícies maiores podem ser analisadas por microscopia eletrônica de varredura, enquanto áreas mais focalizadas são analisadas por microscopia eletrônica de transmissão.
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Fases de um sólido cristalino são caracterizadas pelo seu arranjo tridimensional regular dos átomos. O mapeamento das fases por microscopia eletrônica de varredura fornece informações cristalográficas de regiões micrométricas da amostra através do seu mapeamento espacial ao longo da superfície analisada realizando análises estatísticas referente ao tamanho de grão, orientação, contorno de grão e textura, parâmetros críticos na determinação das propriedades mecânicas de materiais cristalinos. Tais análises podem ser empregadas na caracterização e desenvolvimento de ligas metálicas, identificação de minerais em rochas, a caracterização da microestrutura de dispositivos eletrônicos entre outras aplicações.
Mapa de EBSD de alumínio submetido a deformação plástica severa.
Imagem cedida por Paulo Roberto Cetlin, UFMG.
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Análise pontual, não destrutiva, em pequenos fragmentos de fósseis, artefatos líticos ou metálicos, cerâmicas, ossos e pigmentos usados em pinturas rupestres, dentre outros. Os resultados obtidos permitem conhecer o ambiente de formação não só dos fósseis como também das matérias primas utilizadas pela população de dado contexto arqueológico.
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Análise pontual de minerais, metais, ligas, cerâmicas, polímeros, semicondutores, material biológico, material de próteses médicas e dentárias, etc. Os resultados obtidos com estas análises podem ser utilizados para caracterização de materiais em geral, melhoria de processos, estudos petrológicos, geocronologia, gemologia, pesquisa de minerais satélites de diamante, etc.
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Caracterização química de materiais utilizados em obras de arte, usando-se amostras mínimas das mesmas. Os resultados obtidos podem ser usados para definir procedimentos de restauração ou certificação de obras.
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Obtenção de dados químicos e imagens eletrônicas de possíveis partículas GSR em amostras de perícias criminais.
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O método de Area Scan produz mapas químicos que mostram a distribuição e a concentração relativa de determinados elementos em uma região da amostra. Os dados obtidos podem ilustrar associações minerais e serem úteis na busca de elementos de interesse econômico.
O Line Scan constitui-se de uma série de análises pontuais ao longo de uma linha na superfície da amostra. Os resultados podem ser usados para verificar e ilustrar a variação da concentração (enriquecimento ou empobrecimento) de elementos de interesse.
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A microscopia de varredura por sonda é um conjunto de técnicas de análise de superfície que se baseia na interação de uma sonda mecânica com a amostra. A mais conhecida delas é a microscopia de força atômica, AFM. A microscopia de força atômica gera imagens da superfície das amostras, revelando sua topografia, morfologia e rugosidade em escala nanométrica. É possível também determinar o tamanho de partículas e espessura de filmes finos.
Várias outras técnicas dessa família permitem obter também informações sobre as propriedades elétricas (EFM e KPFM/SKPM), magnéticas (MFM) ou mecânicas (nanoindentação) das amostras.
Fio de cabelo humano (esquerda) e fibras colágenas (direita).
Imagens obtidas por Jéssica de Paula e Luciana Seara, CM-UFMG.
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A microscopia óptica compreende um conjunto de técnicas empregadas para a observação de estruturas em escalas micrométricas não reveladas pelo olho humano. A aplicação da microscopia óptica atende diferentes setores das áreas das Ciências da Vida e de Materiais, que incluem pesquisa biológica e biotecnológica, análises clínicas, física e geologia. A microscopia óptica de campo claro é a técnica mais comumente usada, quando a luz passa através da amostra, fazendo com que a área observada seja bem iluminada. Na microscopia óptica de campo escuro apenas a luz dispersa ou refratada pelas estruturas na amostra alcança a lente. É indicada para amostras com pouco contraste.
Tumor com alteração das glândulas do Intestino Grosso Humano, coloração por Hematoxilina-Eosina (HE).
Imagem cedida e obtida por Priscila Divina Diniz Alves, CM-UFMG.
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A microscopia de contraste de fases pode efetuar a análise de amostras sem a fixação das mesmas nas lâminas e sem uso de corantes. A Microscopia de Contraste de Fases é bastante utilizado nas pesquisas de diversas áreas, na prática clínica, na observação de células e tecidos não corados e é muito usado para análise de células vivas (geralmente em cultura), microrganismos, seções de tecidos finos, fibras, dispersões de látex, partículas subcelulares (incluindo o núcleo e outras organelas), diagnóstico de células tumorais, hematologia, virologia, bacteriologia, parasitologia e biologia marinha.
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Nesse método de contraste, a interação entre o feixe de luz e regiões com índice de refração e espessura diferentes na amostra provoca diferença de fase da onda. Essa diferença provoca contraste interferencial e gera imagens com aparência tridimensional. DIC pode ser usado para observação de amostras vivas e não coradas. Permite também o monitoramento de culturas celulares, estudo de morfologia e taxonomia de parasitas.
Trypanossoma cruzi.
Imagem cedida por Gabriela Burle e Santuza Teixeira, Departamento de Bioquímica e Imunologia, ICB, UFMG.
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A Microscopia Óptica de Fluorescência permite a visualização de moléculas específicas, as quais emitem fluorescência na presença de radiação excitante. O microscópio de fluorescência usa a capacidade de algumas moléculas em fluorescer, sendo que algumas amostras podem ser analisadas por emitirem fluorescência naturalmente (autofluorescência). No caso de amostras que não fluorescem, a fluorescência é introduzida por métodos de marcação, sendo a imunofluorescência um dos mais conhecidos. Diversas são as aplicações da microscopia de fluorescência, como:
- distinção entre células viáveis ou mortas;
- identificação de células;
- exibição/estudo de componentes celulares;
- diagnóstico de microorganismos específicos;
- detecção e localização de proteínas específicas, antígenos e outras componentes dentro da célula;
- monitoramento de processos fisiológicos.
O microscópio de fluorescência do CM-UFMG conta ainda com o sistema Apotome, que usa o princípio da iluminação estruturada, eliminando da imagem a luz proveniente de diferentes planos focais, para que apenas informações do plano focal de interesse permaneçam na imagem. Esse processo melhora o contraste e a resolução da seção óptica, mesmo em amostras mais espessas.
Células endoteliais de artéria bovina marcadas com fluorescência vermelha para mitocôndrias (MitoTracker Red CMXRos), verde para F-actina (BODIPY FL phallacidin) e azul para núcleos (DAPI).
Imagem obtida por Priscila D. D. Alves, CM-UFMG.
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A microscopia de polarização é utilizada na observação de materiais que sejam birrefringentes, ou seja, que possuem diferentes índices de refração. As estruturas birrefringentes, chamadas anisotrópicas, produzirão um tipo de vibração luminosa aparecerá brilhante para o observador, ficando o restante do material escuro. A microscopia de polarização foi usada inicialmente para estudo de minerais, porém hoje também é usado para cimentos, cerâmica e polímeros, sendo muito utilizada para estudos de petrografia e mineralogia. Em materiais biológicos, é usada para o estudo de tecidos como músculo, cabelo, paredes celulares, moléculas de DNA e na detecção de substâncias minerais em tecidos.
Lâmina delgada de rocha vista sob luz transmitida polarizada.
Imagem obtida por Ramon de Oliveira Aranda, CM-UFMG.
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