| Técnicos | |
| Janine Costa Ivo | |
| Thalita Souza Arantes | |
CONGELAMENTO
Congelamento por imersão – Plunge Freezing
Congelamento ultrarrápido, no qual as amostras são imersas em etano líquido (agente criogênico) a uma temperatura de -183 °C. A técnica é indicada para amostras em suspensão aquosa, com tamanho de até 250 nm, como complexos proteicos, vírus, lipossomas, filamentos de citoesqueletos, organelas isoladas, nanopartículas, entre outros.
Congelamento sob alta pressão – High Pressure Freezing
Congelamento em nitrogênio líquido, sob pressão de 2100 bar, que permite a vitrificação de amostras mais espessas (até 200 µm) sem o uso de agentes crio-protetores. É indicada para amostras de tecidos (animal e vegetal), células em suspensão ou em monocamada, emulsões, entre outros. Após congeladas, as amostras podem ser criofraturadas (Freeze Fracture System – Leica EM BAF060) ou submetidas a um processo de substituição a frio (Freeze Substitution – Leica EM AFS2), o que possibilita a inclusão em resinas para microscopia eletrônica de transmissão ou secagem em ponto crítico e metalização para microscopia eletrônica de varredura.
CRIOFRATURA
Método baseado na fratura física de amostras biológicas congeladas (criofratura) que permite analisar detalhes estruturais do plano fraturado por microscopia eletrônica de transmissão. Após fratura, deposita-se uma camada de platina/carbono sobre a superfície, formando-se uma réplica de todo o plano fraturado. Em seguida esta réplica é lavada e depositada sobre uma grade para análise no microscópio de transmissão. Dentre as técnicas de preparo de amostras para microscopia eletrônica, é a única que permite a visualização plana da organização interna de membranas biológicas.
Crio-substituição
Método que se baseia na substituição da água vitrificada (formada durante o congelamento no (High Pressure Freezer – Leica EM HPM 100), contida na amostra, por acetona (solução de substituição). No caso de amostras biológicas, a solução de substituição pode conter fixadores químicos e contrastantes para auxiliar na preservação de estruturas e para aumentar o contraste. Após a crio-substituição, as amostras podem ser embutidas em resina, submetidas ao processo de ultramicrotomia para obtenção de cortes ultrafinos (30 a 90 nm) para análise no microscópio eletrônico de transmissão convencional. Outra opção, é realizar secagem em ponto crítico de CO2, montar em stubs e metalizar para análise no microscópio eletrônico de varredura convencional.
Crio-ultramicrotomia
Obtenção de secções ultrafinas com espessura de 10 nm a 15 µm de amostras mantidas congeladas em câmara fria, em temperatura de -15 °C a -185 °C. As secções podem ser analisadas no microscópio eletrônico de transmissão, microscópio eletrônico de varredura, microscópio de varredura por sonda e microscópio óptico. Indicado para diversos tipos de amostras como: tecido, polímero, metal ou nanopartículas.